LAPORAN PRAKTIKUM
BIOTEKNOLOGI
“ISOLASI DNA”
Disusun
Oleh:
Nama : Ika Riana Hiola
NIM : 115040201111072
Kelompok : Jumat, 06.00 WIB
Asisten : Dita
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
Malang
2012
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada
akhir-akhir ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler.
Pentingnya bioteknologi untuk perkembangan keanekaragaman hayati dimasa
mendatang memerlukan sebuah keterampilan dan pemikiran. Melalui isolasi DNA
tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi mahasiswa mengenai cara
pengumpulan DNA.
Deteksi DNA Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan alat yang dapat
menunjang proses isoasi DNA. PCR merupakan teknik untuk mengamplifikasi DNA
dalam jumlah kecil melalui proses enzimatik secara in vitro. Penggandaan yang
dilakukan PCR bertujuan untuk memperbanyak jumlah DNA agar dalam isolasi dapat
diperoleh DNA dalam jumlah besar. Biasanya mesin itu digunakan sebagai
amplifkasi DNA mikroorganisme. melalui elektroforesis dapat dilakukan dengan
gel agarose dan gel polyacrilamide. Namun, pada praktikum kali ini menggunakan
gel agarose. Karena jumlah DNA yang hanya mencapai 10 ng mampu terdeteksi oleh
gel agarose. Proses elektroforesis gagal dilakukan, waktu dan arus yang terlalu
tinggi ditengarahi menjadi faktor utama kegagalan tersebut.
Isolasi DNA dapat dilakukan,
baik pada manusia maupun pada tumbuhan. Pada praktikum kali ini DNA yang digunakan berasal
dari tanaman
kubis.
1.2 Tujuan
a. Untuk mengetahui pengertian isolasi DNA dan PCR
b. Untuk mngetahui uji kualitas DNA
c. Untuk mengetahui komponen dan tahapan PCR
d. Untuk mengetahui manfaat PCR
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Pengertian Isolasi DNA dan PCR
Isolasi
DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan beratmolekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besarakan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. (Anonymous,
2012)
PCR
adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu
DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita
yang berlawanan dan mengapit dua target DNA (Erlich, 1989).
2.2 Uji Kualitatif DNA
Diawali dengan isolasi
DNA. Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA yang berada dalam inti sel dari
organisme. Kemudian dilakukan dengan uji kualitatif DNA dengan metode
a.
Elektroforesis gel
agarosa.
Uji ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan DNA
dalam larutan contoh (Riyadi, 2009).
Gel yang digunakan adalah agarosa yang
berasal dari ekstrak rumput laut yang telah dimurnikan (Mikkelsen & Corton
1960).
b. Metode spekrofotometri.
Spektrofotometri
merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa
berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya.
Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer.
Spektrofotometer
menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara
fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi
(Riyadi, 2009).
Pengukuran jumlah DNA dengan
spektrofotometer didasarkan pada prinsip iradiasi sinar ultraviolet yang
diserap oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Analisis asam nukleat
umumnya dilakukan untuk penentuan konsentrasi rata-rata dan kemurnian DNA yang
terdapat dalam sampel. Jumlah dan kemurnian tertentu diperlukan untuk kinerja
optimal sampel DNA yang digunakan. Asam nukleat menyerap sinar ultraviolet
dengan pola tertentu. Sampel ditembus sinar ultraviolet dan fotodetektor cahaya
pada 260 nm, semakin besar cahaya yang diserap sampel, maka semakin tinggi
konsentrasi asam nukleat dalam sampel (Sambrook & Russel 2001).
2.3
Komponen dan Tahapan PCR
Pada proses PCR diperlukan beberapa
komponen utama yaitu
(Yuwono, 2006) :
a.
DNA cetakan. Adalah fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. DNA
cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105 - 106 molekul. Dua hal
penting tentang cetakan adalah kemurnian dan kuantitas.
b.
Oligonukleotida primer. Adalah suatu sekuen oligonukleotida pendek (18 - 28 basa
nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA dan mempunyai
kandungan G + C sebesar 50 - 60%.
c.
Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP). Terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP. dNTP
mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah konsentrasi efektif ion. Ini yang
diperlukan untuk reaksi polimerasi.
d.
Enzim DNA Polimerase. Adalah enzim yang melakukan katalisis reaksi
sintesis rantai DNA.
e.
Senyawa buffer.
Sedangkan untuk tahapnya, ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang
selalu terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengan cepat yaitu :
(Yuwono, 2006)
a. Denaturasi
Di dalam proses PCR, denaturasi awal
dilakukan sebelum enzim taq polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi.
Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai
tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa
molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak
lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi)
secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu
denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase.
Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5
menit masing-masing pada suhu 92,5, 95 dan 97,5°C.
b. Annealing
(penempelan primer)
Kriteria yang umum digunakan untuk
merancang primer yang baik adalah primer sebaiknya berukuran 18 - 25 basa,
mengandung 50 - 60 % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama.
Sekuens DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling
berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder
pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR. Waktu annealing yang biasa digunakan
dalam PCR adalah 30 - 45 detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi
temperaturnya. Kisaran temperatur penempelan yang digunakan adalah antara 36°C
sampai dengan 72°C, na mun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 -
60°C.
c. Pemanjangan
Primer (Extention)
Selama tahap ini Taq polymerase memulai
aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3'. Kecepatan penyusunan
nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72°C diperkirakan 35 - 100 nukle
otida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul
DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasang basa,
waktu 1 menit sudah lebih clad cukup untuk tahap perpanjangan primer ini.
Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai
5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda. Reaksi-reaksi
tersebut di atas diulangi lagi dari 25 - 30 kali (siklus) sehingga pada akhir
siklus akan diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang merupakan
hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah
DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada
konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi.
2.4 Manfaat PCR
Keunggulan PCR dikatakan sangat tinggi. Hal
ini didasarkan atas:
a.
Spesifitas, efisiensi dan keakuratannya. Spesifitas
PCR terletak pada kemampuannya mengamplifikasi sehingga menghasilkan produk
melalui sejumlah siklus. Keakuratan yang tinggi karena DNA polymerase mampu menghindari
kesalahan pada amplifikasi produk. Masalah yang berkenaan dengan PCR yaitu
biaya PCR yang masih tergolong tinggi. (Yuwono, 2006)
b.
Dilakukan untuk
menjamin bahwa jumlah DNA yang akan amplifikasi dengan PCR mempunyai
konsentrasi yang sama dengan harapan jumlah amplifikasi DNA juga seragam
(Sambrook & Russell 1989).
Dua
hal di atas yang mendasari manfaat PCR digunakan untuk:
1.
Keragaman genetik tanaman (kekerabatan)
Suatu tingkatan biodiversitas yang merujuk pada jumlah
total variasi genetik dalam keseluruhan spesies yang
mendiami sebagian atau seluruh permukaan bumi yang dapat didiami. Ia berbeda
dari variabilitas genetik, yang menjelaskan
kecenderungan kemampuan suatu karakter/sifat untuk bervariasi yang dikendalikan
secara genetik (wikipedia, 2012).
2.
Seleksi
Tanaman yang dapat diperbanyak
secara klonal merupakan tanaman yang relatif mudah proses seleksinya. Keturunan
pertama hasil persilangan dapat langsung diseleksi dan dipilih yang menunjukkan
sifa-sifat terbaik sesuai yang diinginkan. (Wikipedia, 2012).
3.
Uji Kemurnian Benih
Kemurnian
benih adalah merupakan persentase berdasarkan berat benih murniyang terdapat
dalam suatu contoh benih. (Sutopo, 1984).
Salah satu
pengujian yang dilakukan untuk menyediakan benih yang masih mempunyai tingkat
kemurnian tinggi, yaitu tidak tercampur dengan varietas lain, kotoran maupun
benih yang rusak. Kemurnian benih sangat penting dilakukan terutama dalam
menjaga suatu kualitas varietas unggul.
BAB III
METODOLOGI
3.1
Alat dan Bahan
3.1.1 Alat Isolasi DNA
— Timbangan analitik, untuk menimbang bahan
— Incubator, sebagai
tempat untuk
menginkubasi dan untuk
mengaktifkan CTAB
— Sentrifuge, untuk
memisahkan antara supernatant,fase organic dan fenol
— Mikropipet dan tip-nya ,
digunakan untuk
membantu memasukkan larutan
— Beaker glass, sebagai tempat bahan
— Tabung reaksi, tempat mereaksikan
larutan
— Mortar dan penumbuknya, untuk menumbuk daun kubis
supaya lebih halus
— Labu Erlenmeyer, sebagai
tempat
larutan
— Vortex , untuk menghomogenkan
larutan
— Freezer, untuk menginkubasi
larutan
— TUB, sebagai tempat larutan
3.1.2 Bahan Isolasi DNA
— Daun
srikaya, sebagai
bahan praktikum
— Alkohol, untuk mensterilkan
— Nitrogen cair, untuk membantu
penggerusan dan penghalusan tumbukan daun dan merusak dinding sel
— CTAB & Merchapbethanol, untuk memecah dinding sel
dan menjaga DNA agar tidak rusak
— CIA (Chloroform Isoamile
Alcohol), untuk
mengeluarkan isi sel dan untuk mengurangi kontaminasi protein dan polisakarida
— Isoprophanol dingin, untuk membantu
dalam proses penggumpalan DNA menjadi benang-benang DNA
— Buffer pencuci, untuk mencuci larutan
— Tris EDTA, untuk
meresistensi
3.2 Langkah Kerja
Buffer ekstraksi Timbang sample 0,3gr CTAB (1
ml) +PVP
1 %
+inkubasi
30’ (650C)
Chisam
500µl
Sentrifuse
10000 Rpm 10’
Ambil
Supernatan
Chisam
1x volume supernatant (1:1)
Sentrifuse
6000 rpm 10’
Isopropanol
0,45 x volume supernatant
Inkubasi
freezer 30’
DNA
pellet
+
Buffer Pencuci 200µl
+RNAse
1µl (350C)
+Resuspensi
dengan elution buffer 20-50µl
Simpan
untuk elektroforesis
Siapkan
DNA + loading dye
Siapkan elektroforesis tank dengan
larutan TBE
Ready
3.3
Analisa Perlakuan
Pada praktikum isolasi DNA
ini, menggunakan daun srikaya sebagai objek pengamatan praktikum. Daun yang
telah dipotong kecil-kecil ditumbuk dengan mortar dengan diberi Nitrogen cair
untuk mempercepat proses penumbukan menjadi bubuk dan telah diberkan PVP 1%,
buffer ekstraksi, β mercaptoetamol, dan diinkubasi selama 30 menit. Setelah itu
diberi chisam lalu difortex dan disentrifuse selama 10 menit. Supernatan
diambil kemudian difortex kembali dan ditambahkan chiasm dan supernatant (1:1),
dan disentrifuse kembali selama 10 menit. Lalu ditambahkan isopropanol 0,45 x
volume supernatant dan diinvert dan diinkubasi pada freezer selama 30 menit,
disentrifuse kembali dan isopropanol dibuang. Didapatkan DNA pellet dan diberi
Buffer pencuci 2x, ditambah RNAse 1µl dan resuspensi dengan elution buffer, kemudian
simpan untuk elektroforesis.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Gambar Hasil Elektroforesis
KETERANGAN
GAMBAR HASIL ELEKTROFORESIS DNA TOTAL
SAMPLE 1 =
SRIKAYA
SAMPLE 2 =
SRIKAYA (ADA)
SAMPLE 3 =
SRIKAYA (ADA)
SAMPLE 4 =
TOMAT
SAMPLE 5 = TOMAT
SAMPLE 6 =
BAYAM
SAMPLE 7 =
BAYAM (ADA)
SAMPLE 8 =
BAYAM
SAMPLE 9 =
UBI JALAR
SAMPLE 10 =
UBI JALAR
SAMPLE 11 =
UBI JALAR
SAMPLE 12 =
JERUK (ADA)
SAMPLE 13 =
JERUK (ADA)
4.2 Analisa
Gambar Hasil Elektroforesis
Dari
hasil gambar diatas dapat diketahui bahwa penyinaran dibawah lampu UV dapat
dilihat berupa potongan pita-pita DNA yang mempunyai fragmen-fragmen. Pada daun
srikaya dapat diketahui bahwa salah satunya potongan fragmen pita DNA yang
banyak terurai dan kurang sempurna karena pengaruh konsentrasi agarose yang
menyebabkan DNA bermigrasi, sehingga fragmen-fragmennya lebih besar.
Dari
setiap bahan yang dilakukan untuk praktikum ini tidak semua akan muncul pita
DNA saat dielektroforesis. Hal ini dikarenakan kurang efektifnya perlakuan saat
praktikum dan kesterilan alat dan bahan praktikum. Hal ini menyebabkan tidak
munculnya pita DNA saat dielektroforesis dibawah lampu UV.
Pada
elektroforesis tersebut terdapat bermacam-macam kontaminasi, diantaranya smear
(semburan) yang diakibatkan karena adanya kontaminasi protein dan DNA
terdegradasi, berapi-api yang disebabkan karena adanya kontaminasi
polisakarida, dan pita tebal dibawah bagian bawah gel agarose yang disebabkan
karena adanya kontaminasi RNA. (Asris, 2010)
Dari gambar
hasil elektroforesis ini dapat diketahui bahwa adanya kontaminasi polisakarida
dengan ditunjukkan adanya gambar berapi-api diatas pita DNA yang sangat
tebal.
BAB V
PENUTUP
5.1
Kesimpulan
Isolasi DNA merupakan suatu
proses untuk mendapatkan DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan
pemeriksaan atau diagnosa.
Dalam praktikum ini,
diguanakan daun srikaya untuk proses pengisolasian DNA. Alat yang digunakan
antara lain mikropipet, mortar, fortex, sentrifuse, elektroforesis, dan
lainnya. Bahan yang digunakan diantaranya nitrogen cair, Buffer CTAB, PVP,
Chisam, Isopropanol, dan lainnya.
Pada praktikum isolasi DNA
ini saat disentrifuse pertama kali didapati hasil adanya 3 larutan yang
terpisah satu sama lain yaitu, lapisan atas disebut supernatant (Chisam+DNA),
lapisan tengah yaitu fase organic, dan lapisan bawah yang disebut fenol.
Sedangkan sentrifuse yang kedua yaitu hanya larutan supernatant yang digunakan
sehingga ada 2 material yang terpisah yaitu lapisan atas (DNA) berwarna putih
dan lapisan bawah (Chisam) berwarna bening.
5.2
Kritik dan Saran
Saat penyampaian materi di
dalam ruang sangat membosankan, coba buat cara lain agar tidak membosankan dan
saat praktikum jangan terlalu cepat saat penyampaiannya. Karena isolasi DNA ini
cukup sulit mas, mbak. Terima kasih.
DAFTAR
PUSTAKA
Asris.
2010. Isolasi DNA. http://asris07.student.ipb.ac.id/
2010/06/19/isolasi-dna/. Diakses tanggal 25 November 2012
Erlich,
HA. 1989. PCR Technology Principles And
Application For DNA Amplification. New York: M Stockton Press.
Mikkelsen dan Corton. 1960. Bioanalytical Chemistry. Canada : John Wiley.
Riyadi, W. 2009. Macam
Spektrofotometri dan Perbedaannya (Vis, UV dan IR).
http://wahyuriyadi.blogspot.com. Diakses tanggal 16 November 2012.
Riyadi,
W. 2009. Prinsip Dasar Spektrofotometer
Visible. http://wahyuriyadi.blogspot.com. Diakses tanggal 16 November 2012
Sambrook
& Russel.2001. Moleculer Cloning.
A Laboratory Manual Ed ke-3
Sutopo,
L. 1984. Teknologi Benih . Jakarta:
Penerbit CV. Rajawali.
Wikipedia, 2012. http://id.wikipedia.org/wiki/Keanekaragaman_genetik..
16 November 2012.
Wikipedia, 2012. http://id.wikipedia.org/wiki/Pemuliaan_tanaman.
16 November 2012.
Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain, Panduan
Eksperimen PCR untuk Memecahkan Masalah Biologi Terkini. Yogyakarta.
Yuwono.
2006. Biologi Molekuler. Jakarta :
Erlanggga.
Dokumentasi
1. Persiapan Alat dan Bahan
2.
Masukkan
ke dalam mortar,yang mana sebelumnya sudah diberi alcohol supaya steril. Mengambil Buffer ekstraksi CTAB 1 ml
dan 0,3 g daun srikaya + pvp 1 % + larutan carbon aktif
3.
Ditambah
Nitrogen cair,tujuannya untuk merusak dinding sel dan membantu proses
penggerusan.
4. Digerus sampai
halus,karena mempengaruhi banyak atau tidaknya DNA yang akan diisolasi.
5. Masukkan kedalam TUB
6.
Tambahkan
CHISAM 500 µL, sentrifuge 10000 rpm 10 menit, Dihomogenkan menggunakan
vortex
7.
Ambil
supernathan
8.
Tambahkan
CHISAM 1x vol supernatan, Dihomogenkan menggunakan vortex
9. Sentrifuge 1000 rpm 10
menit
10. Tambahkan isopropanol
0,45 x vol. supernatan
11. Invert, kemudian inkubasi
freezer 30 menit. Sentrifuge 10000 rpm
12. Buang isopropanol. Dapat
DNA pelet, tambahkan buffer pencuci 200 µL du kali
13. Tambahkan RNASE 1 µL,
lalu resuspensi dengan elution buffer 20-50 µL
14.
Simpan
untuk elektroforesis
Jika
elektroforesis jadi, maka
1.
Siapkan
gel agarose 0,32 gr/ 40 ml
2.
Siapkan
DNA, tambahkan loading days
3.
Siapkan
glokerophorosis tank dengan larutan TBE
Tidak ada komentar:
Posting Komentar