Laporan Praktikum Bioteknologi

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

“ISOLASI DNA KASAR”

Disusun Oleh:

Nama            : Ika Riana Hiola

NIM              : 115040201111072

Kelompok     : Jumat, 06.00 WIB

Asisten          : Dita

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

Malang

2012

BAB I

PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.

DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontamoinasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder  seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan flavonoid. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat, dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi diatas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitive oleh enzim retriksi dsan mengganggu proses amplifikasi DNA dengan PCR.

1.2 Tujuan

a.       Mengetahui Definisi Isolasi DNA

b.      Mengetahui metode dan tahapan dalan isolasi DNA

c.       Mengetahui manfaat isolasi DNA

1.3 Manfaat

Mahsiswa dapat mengetahui dan melakukan proses-proses yang berkaitan langsung untuk melakukan isolasi DNA.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi Isolasi DNA

DNA isolation is the most important step in molecular biology analysis. Several DNA isolation techniques which are developed were expensive. (Listanto,1996) Arti: Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama.

2.2  Macam-macam Metode Isolasi  DNA

Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) dengan Nitrogen Cair.

Ø  Metode I.

Daun temulawak sebanyak 1 gram digerus dengan PVP dannitrogen cair hingga menjadi tepung. Sebanyak 10 mL bufer ekstraksi hangat dan 2.5 mL 2-merkaptoetanol ditambahkanke dalam sampel dan diinkubasi sambil digoyang perlahan pada suhu 55 C, kecepatan 150 rpm selama 1 jam. Selanjutnya diekstraksi ulang dengan kloroform:isoamil alkohol (24:1) sebanyak 10 mL. Selanjutnya, dilakukan pemisahan dengan sentrifugasi pada kecepatan 1000 g selama 5 menit. Aliquot yang terdapat pada bagian atas dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan isopropanol dingin sebanya 2/ volume. Kemudian diinversi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Pelet dikoleksi dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 20 menit. Pelet dicuci dengan buffer pencucii (etanol 76% dan ammonium  asetat). Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 14000 g selama 10 menit. Pencucian dilakukan sebanyak 2 kali. Pelet yang telah dicuci selanjutnya ditambahkan dengan bufer TE dan ditambahkan RNAse A dengan konsentrasi final 10 ug/mL. RNAse A diaktivasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Selanjutnya, dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 5 menit. Pelet yang dihasilkan diresuspensi dengan molecular water. Proteinase K ditambahkan dengan dua variasi penambahan.

Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) tanpa Nitrogen Cair.

Ø  Metode II.

Sampel daun sebanyak 0.2 gram dan digerus dengan

PVP dan 0.75 mL buffer ekstraksi (2% b/v CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 8), 0.2% (v/v) 2- merkaptoetanol). Inkubasi dilakukan dengan incubator shaker pada suhu 65°C dengan 50 rpm selama satu jam. Sampel kemudian dibiarkan pada suhu ruang untuk proses cooling. Sampel ditambahkan 0.75 mL kloroform: isoamil alkohol (24:1) dan disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan berisi DNA dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan 2/3 volume isopropanol dingin kemudian diinversi perlahan sebanyak 10 kali. Smapel tersebut disentrifugasi 11.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Pelet yang telah kering diberi 25 μL molecular water dan disimpan pada suhu -20°C.

Metode Ekstraksi Modifikasi Zheng et al (1995).

Ø  Metode III.

Sampel daun 200 mg digerus hingga halus dan ditambahkan buffer ekstraksi (25 mM EDTA (pH 7.5),

50 mM TrisHCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, dan SDS 1%) sebanyak 400 μL dalam mortar dingin. Sampel ditambahkan 100 μL buffer ekstraksi di dalam tabung dingin dan ditambahkan 400 μL kloroform kemudian diinversi. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu 4oC. Lapisan atas yang terbentuk ditambahkan 800 μL etanol absolut dan diinkubasi pada suhu -20oC selama 1 jam. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 3 menit pada suhu 4oC. Endapan berupa pellet DNAditambahkan 500 μL Etanol 70% dan disentrifugasi kembali. Pellet yang telah kering diresuspensi dengan 50 μL molecular water dan ditambahkan RNAse serta diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Sentrifugasi 10000 rpm dilakukan selama 5 menit. Pellet kering ditambahkan 50 μL molecular water. Suspensi tersebut disimpan pada suhu -20oC.

Ketiga metode tersebut di atas dimodifikasi untuk mendapatkan DNA genom dengan kualitas terbaik. Modifikasi dilakukan dengan variasi penambahan etanol 76%, buffer pencuci (etanol 76% dan ammonium asetat 3M), Proteinase K, RNAse A, kalium asetat 5M, dan PVP. Selain itu, modifikasi juga dilakukan dengan variasi penambahan larutan pada tahap yang berbeda.

(Utami, 2012)

2.3 Tahapan Isolasi DNA

Pada prinsipnya isolasi DNA sel harus dipecah terlebih dahulu dengan beberapa agensia, baik secara fisik kimia atau dengan mempergunakan enzim tertentu. Pemecahan dengan cara fisik misalnya dengan menggunakan alat sonikator, yaitu merupakan alatb yang menghasilkan suara  ultra tinggi. Pemecahan dengan alat ini biasanya cukup fektif untuk memecah sel bacteri, tetapi kurang efektif untuk memecah sek eukaryote.

Pemecahan sel juga dapat dilakukan dengan menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah dinding sel. Seringkali penggunaan enzim ini dikombinasikan dengan perlakuan fisik, misalnya dengan pemansan sehingga sel lebih mudah pecah. Senyawa lain yang sering digunakan untuk memecah sel untuk isolasi DNA adalah CTAB (Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide).

Setelah sel pecah selanjunya dilakukan isolasi dan pemurnian DNA. Untuk mengisolasi suatu fragmen DNA  tertentu, DNA genom kemudian dipotong dengan menggunakan enzin endonuclease  restriksi, enzim ini enzim yang dapat memotong molekul DNA  di bagian tertentu. Hasil potongan dengan enzim tertentu akan menghasilkan ujung-ujung DNA yang sama sesuai dengan titik  potong oleh enzim.

Selain  dengan menggunkan enzin endonuclease restriksi, DNA genom juga dapat dipotong-potong secara mekanis, misalnya menggunakan alat sonikator.Hasil potongan dengan alat mekanis adalah molekul DNA  yang ujungnya tidak beraturan.

 (Yuwono,2006)

2.4 Manfaat Isolasi DNA

·         Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.

·         Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melaluiteknik Hibridisasi Southern

·         Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.

·         Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA.

·         Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur  perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR.

( Anonymous a.2012 )

BAB III

 METODOLOGI

3.1   Alat, Bahan dan Fungsi

A.     Alat

Mortar            : Untuk melembutkan bahan

                         praktikum

Pastle              : Untuk melembutkan bahan

                         praktikum

Erlem mayer   : Wadah aquades

Cawan            : Sebagai wadah detergen.

Saringan         : Untuk menyaring bahan yang di

                         ek- straksi

Spatula           : Untuk mengaduk  dan mengambil

                         bahan praktikum

Pisau              : Untuk memotong bahan agar lebih

                         kecil agar mempermudah dalam

                         menghalus- kannya.

Timbangan     : Untuk menimbang bahan

                         praktikum

Tabung Reaksi: Untuk meletakkan bahan yang

                         sudah di haluskan dan untuk

                         mereaksikan bahan.

Gelas ukur      : untuk wadah pasta

B.     Bahan

Kubis                         : Sebagai bahan praktikun

                                    yang akan di amati

Aquades                     : Untuk melarutkan detergen

                                     dan garam

Detergen (@2,5 gr)     : Bu cream, bubuk, cair

                                    untuk merusak dinding sel

                                    dan meluruhkan DNA.

3.2  Langkah Kerja

 

3.3 Analisa Perlakuan

Pada praktikum isolasi DNA kasar menggunakan bahan praktikum kubis dan detergen bubuk, detergen cair dan detergen krim. Perbedaan dari penggunaan detergen ini bertujuan untuk mengetahui daya rusak paling tinggi yang diakibatkan dari masing-masing detergen tersebut. Detergen tersebut dimasukkan kedalam ekstrak buah mangga yang sudah dihaluskan sebelumnya. Dan diamati perbedaan DNAnya dari tiap masing-masing ekstrak mangga yang telah diberikan perlakuan detergen yang berbeda-beda. Detergen mana yang paling jelas dan paling banyak menghasilkan DNA dari kubis tersebut. Sumber DNA ini dihaluskan  yang bertujuan untuk merusak membran sel, dinding sel dan membrane inti sehingga DNA bisa keluar dari sel dan masuk ke larutan. Setelah dihaluskan, ekstrak buah ditambah garam dapur dan disaring serta ditambah etanol absolute dingin. Penambahan NaCl bertujuan untuk memudahkan pemisahan benang-benang DNA dari larutan sehingga benang-benang DNA tersebut akan mudah diamati.

BAB IV

 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1  Hasil (Dokumentasi dan Keterangan)

Dokumentasi	Keterangan
	Penghalusan mangga sebanyak 5gr menggunakan mortar+pistil
	Hasil dari penghalusan mangga dan larutan dari masing-masing detergen (detergen bubuk,detergen cair,detergen krim)
	Ekstrak mangga sudah dicampur kedalam masing-masing jenis detergen dan siap disaring
	Ektrak mangga sudah disaring dan diletakkan pada tabung reaksi, dan amati DNA yang paling jelas terlihat serta paling banyak menggandung DNA diantara ketiga jenis detergen tersebut.

4.2  Pembahasan di banding dengan literature

Dari hasil praktikum isolasi DNA menggunkan bahan mangga dengan 3 macam detergen yang berbeda yaitu detergen bubuk,cair dan krim didapatkan hasil benang-benang DNA yang berbeda banyaknya. Paling banyak DNA yang dihasilkan adalah dari penggunaan detergen bubuk, namun pada hasil DNA dengan menggunakan detergen cair menghasilkan DNA ynag lebih jelas terlihat namun jumlah benang-benang DNA nya sedikit. Dan yang terakhir adalah detergen krim yang mengahasilkan jumlah DNA paling sedikit.

Menurut Jamilah (2005: 95) Perbedaan detergen mempengaruhi tingkat pemunculan DNA dalam isolasi DNA, ini disebabkan karena kandungan detergen tersebut berbeda, misalnya lauryl sulfat yang dapat berfungsi sama dengan dodesil sulfat dan disodium EDTA, serta kandungan zat pewarna dan zat aktif pemutih yang biasanya ada dalam detergen bubuk. DNA yang telihat dengan menggunakan deterjen bubuk lebih banyak daripada deterjen krim dan cair, karena dalam detergen bubuk, kandungan senyawa kimia untuk melisiskan membran sel terdapat dalam konsentrasi yang lebih tinggi daripada detergen jenis lain. Deterjen bubuk menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen cair memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan warna filtrat mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama atau hampir sama dengan filtrat. Sementara pada isolat yang dihasilkan dari filtrat yang menggunakan detergen padat tidak menunjukkan adanya prespitasi DNA yang baik, kalaupun ada, konsentrasi dan viskositasnya sangat rendah. 

BAB V

PENUTUP

5.1  Kesimpulan

 Dari hasil praktikum isolasi DNA didapatkan bahwa penggunaan detergen bubuk paling banyak menghasilkan benang-benang DNA pada kubis.

Hal ini disebabkan karena karena dalam detergen bubuk, kandungan senyawa kimia untuk melisiskan membran sel terdapat dalam konsentrasi yang lebih tinggi daripada detergen jenis lain. Deterjen bubuk menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan warna filtrat mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama atau hampir sama dengan filtrate.      

5.2  Saran

Untuk praktikum : alat-alat yang dibutuhkan tolong dilengkapi lagi sesuai apa yang dibutuhkan.

Untuk assiten : Mohon penjelasannya lagi tentang materi PCR dan tahap pengujian isolasi DNA murni.

DAFTAR  PUSTAKA

Anonymous a .2012.Tujuan Isolasi DNA. http://www.  scribd.com / doc/69290030/Isolasi-Dna-n-Elektroforesis. Diakses pada tanggal 2 Desember 2012

Listanto, E; pardal,s.j; Wang, k. 1996. Jurnal Bioteknologi Pertanian, Indonesian Journal of Agricultural Biotechnologi. Metode sederhana isolasi DNA  dari tanaman jagung transgenic untuk polymerase chain reaction. Balai penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. Bogor

Nicho.1993;Surzycki.2000.IsolasiDNA.http://anieez87.blogspot.com/.  Diakses pada 2 Desember 2012

Utami,  Annisa; Riani Meryalita; Nur Aeny Prihatin; Laksmi Ambarsari; Popi Asri Kurniatin; Waras Nurcholis.2012. Variasi metode isolasi DNA daun temulawak (cucurma xanthorrhiza). Prosiding seminar nasional kimia Unesa. Surabaya

Yuwono, Triwibowo.2006. Bioteknolgi Pertanian. Gadjag Mada University Press. Yogyakarta

Zubaidah.2004. Isolasi DNA Buah. http://aan-annas.blogspot.com/2010/11/isolasi-dna-buah-tomat-dan-pepaya.html .Diakses pada 2  Desember 2012.